黄曲霉毒素检测整体解决方案书

黄曲霉毒素检测之柱后光化学衍生系统

一、黄曲霉毒素介绍  

黄曲霉毒素(aflatoxin,简称为AF)是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素。它可通过多种途径污染食品和饲料,直接或间接进入人类食物链,威胁人类健康和生命安全,对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重,该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物,普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中。黄曲霉毒素比较耐热,加热至230才能被完全破坏,因此一般烹饪加工也不易消除。  

二、黄曲霉毒素对人体的危害  

1 引起急、慢性中毒:  

黄曲霉毒素是剧毒物质,其毒性相当于氰化钾的10倍,砒霜的68倍。黄曲霉毒素属肝脏毒,除抑制DNARNA的合成外,也抑制肝脏蛋白质的合成,黄曲霉毒索引起人类的急性中毒事件,国内外均有许多报导,最典型的是印度的霉变玉米事件,该事件直接导致了数十人丧生,数百人患上不同类型的肝脏疾病。  

2、 致癌性:  

黄曲霉毒素有极强的致癌性,长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍,是目前公认的致癌性最强的物质之一。另据世界卫生组织报导,黄曲霉毒素含量在30~50ug/kg时为低毒,50~100ug/kg时为中毒,100~1000ug/kg时为高毒,1000ug/kg以上为极毒。鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性,我国对其在食品中的含量作了严格规定,其中,乳制品中黄曲霉毒素最高允许量为5ug/kg(即5ppb)。

三、黄曲霉毒素的种类  

黄曲霉毒素主要有4种:即B1B2G1G2,其中B1被认为是主要的有毒物质,有2种这些毒素的代谢产物M1M2。其中黄曲霉毒素B1主要存在于农产品,动物饲料,中药等产品中;黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体内经羟基化代谢的产物,一部分从尿和乳汁排出,一部分存在于动物的可食部分,如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中,其中以乳最为常见。黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒素B1的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿的主要食品,所以其危害性更大。

四、最新政策及国标(含国外一些政策)  

1 200381日起,凡在我国境内从事米、面、油、酱油、醋生产加工的企业,其产品须经检验合格后方可上市。国家质检总局发布的《关于印发小麦粉等5类食品生产许可证实施细则的通知》中明确规定,黄曲霉毒素B1必须检测。  

2 在第八期《中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局公报》中发布关于黄曲霉毒素检测方法的最新国标:  

1)、GB/T 18979-2003 《食品中黄曲霉毒素的测定——免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》  

2)、GB/T 18980-2003 《乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定——免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》  

以上两项国标均在200381日开始实施  

3200224日欧盟决议对从中国进口或委托从中国进口的花生和花生制品实施黄曲霉毒素强制性检测的特殊条件  

五、中国及国际上对黄曲霉毒素的检测标准  

1、主要国家:  

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2、其他  

(1)WHO/FAO标准。国际卫生组织(WHO)/世界粮农组织所属的食品法典委员会(CAC)推荐食品、饲料中黄曲霉毒素最大允许量标准为总量(B1+B2+G1+G2)小于15μg/kg;牛奶中M1的最大允许量为05μg/kg  

(2)、南非标准。1990颁布了黄曲霉毒素的最大允许标准:食品中黄曲霉毒素总量小于10μg/kg,其中黄曲霉毒素B1小于5μg/kg  

(3)、其他标准。印度标准是花生中黄曲霉毒素B1小于30μg/kg;越南和阿根廷的标准为黄曲霉毒素B1小于20μg/kg  

六、黄曲霉毒素检测方法  

测定黄曲霉毒素测定的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法。这些方法中,国标方法免疫亲和柱法是现在国际公认的比较经济有效的分析方法。有着较好的权威性和通用性,且为国外多个组织认可,被列为标准方法,如:  

美国公职分析化学家协会(AOAC  

美国农业部联邦谷物检测中心(FGIS  

国际纯粹与应用化学协会(IUPAC  

美国食品药品行政署(US-FDA  

美国农业部(USDA  

同时在国内被认证的机构:  

中国出入境检验检疫局(CIQ

七、黄曲霉毒素检测免疫亲和柱法方法有以下特点:  

1 认证机构广泛,通用性强

2 分析速度快,一个样品只需10-15分钟,其他传统的方法要做到定量分析需要几小时至几天的时间。  

3 灵敏度高,测定范围广泛(0-300ppb,用荧光计可以测定0.1ppb的黄曲霉毒素四种异构体,用HPLC可以检测出10ppt的黄曲霉毒素B1  

4 采用单克隆免疫技术,可以特效性地将黄曲霉毒素和其他真菌毒素分离出来,分离效率和回收率高,正确性和可靠性强。  

八、黄曲霉毒素检测免疫亲和柱法方法具体步骤如下:

   1、试剂配制

     1)样品提取溶剂:甲醇/水(4/1v/v

25mmol磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH7.2)母液配制:

1)称取50.14gNa2HPO4.12H2O溶解于700ml水中。

2)称取9.66gNaH2PO4.H2O溶解于350ml水中。

3)将上述两种溶液进行混合并加入42.5gNaCl,配制成pH7.2 5mmol磷酸盐缓冲溶液

31mmol磷酸盐缓冲溶液(PBS)pH7.2)工作液配制:

200ml 5mmol磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)稀释于800ml水中。

4)磷酸盐缓冲溶液(PBS/吐温(Tween)配制:

8ml吐温-20稀释于92mlpH7.2磷酸盐缓冲溶液中

5HPLC 流动相配制: /甲醇/乙腈(60/30/15,v/v

2、样品处理方法:

方法一:标准方法

 该处理程序适用于样品基质中没有干扰,主要适用于大多数谷类样品的处理。

1、取20g样品加入100ml提取液(甲醇/水,4/1v/v)放入匀浆机中,并高速搅拌5分钟。

2、用滤纸过滤上述提取液

3、取14ml过滤后的提取液加入86ml1mmolPBS缓冲溶液(pH 7.2)。如果样品量比较少,取样品体积可以适当减少(如1.4ml+8.6ml缓冲溶液)。如混合过程中有沉淀产生,样品需要用注射过滤器进行过滤或进行离心。

4、打开净化柱上密封盖和下面堵头后,柱中的缓冲溶液会排出,直到缓冲溶液液面达到柱中填料上层处。

5、取5-50ml稀释后的提取液(取样体积根据分析方法的灵敏度来确定)上AflaCLEANTM柱。在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压;但必须保证过柱流速不大于1-2/秒。尽量让所有上样样品都通过柱子流出来,即使柱中溶剂流干了也没有太大问题,但是要避免柱子溶剂完全流干。

6、用10ml蒸馏水或纯化水清洗柱子

7、用气体吹扫或抽真空除去柱子中残余的水

8、每次用1ml甲醇洗脱柱子,可洗2次。第一次加入的甲醇需用堵头堵住柱子下端,使甲醇在净化柱中保持5min后,再放出收集。

9、根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行HPLC分析。

方法二:标准方法加正己烷分层

 该样品处理方法针对样品中含有油脂比较多,如坚果类,一些香料或无花果酱,脂肪和样品中含有一些需要用正己烷去除的杂质。

1、称取20g样品并加入2g的氯化钠

2、加入100ml提取溶剂(甲醇/水,4/1v/v)和50ml正己烷于匀浆机中高速搅拌5min

3、静止分层,取下层液进行下一步处理

4、取下层液用滤纸过滤

5、取14ml过滤后的提取液加入86ml 1mmolPBS缓冲溶液(pH 7.2)。如果样品量比较少,取样品体积可以适当减少(如1.4ml+8.6ml缓冲溶液)。如混合过程中有沉淀产生,上柱液需要用注射过滤器进行过滤或进行离心。

6、打开净化柱上端密封盖和下端堵头后,柱中的缓冲溶液会排出,直到缓冲溶液液面达到柱中填料上层处。

7、取5-50ml稀释后的提取液(取样体积根据分析方法的灵敏度来确定)上AflaCLEANTM柱。在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压;但必须保证过柱流速不大于1-2/秒。尽量让所有上样样品都通过柱子流出来,即使柱中溶剂流干了也没有太大问题,但是要避免柱子完全溶剂流干。

8、用10ml蒸馏水或纯化水清洗柱子

9、用气体吹扫或抽真空除去柱子中残余的水

10 每次用1ml甲醇洗脱柱子,可洗2次。第一次加入的甲醇需用堵头堵住柱子下端,使甲醇在净化柱中保持5min后,再放出收集。

11 根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行HPLC分析。

方法三:标准方法加正己烷分层和PBS/Tween稀释

 该处理过程用于样品含有干扰杂质,主要是大部分的香料和中草药。

1、此处理过程样品最大取样量为20g(一些样品需要减少取样量可以达到比较好的提取效果)。

2、称取20g样品并加入2g氯化钠

3、样品先进行均质化处理,向处理好的样品中加入100ml提取溶剂(甲醇/水,4/1v/v)和50ml正己烷于匀浆机中并高速搅拌5min

4、提取液静止分层,取下层溶液进行下一步处理

5、取下层溶液用滤纸过滤

6、取5ml滤液加入35mlPBS/Tween溶液稀释。如稀释混匀中出现沉淀,需用注射过滤器进行过滤或离心。

7、打开净化柱上端密封盖和下端堵头后,柱中的缓冲溶液会排出,直到缓冲溶液液面达到柱中填料上层处。

8、取14ml稀释后的提取液(取样体积根据分析方法的灵敏度来确定)上AflaCLEANTM柱。在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压;但必须保证过柱流速不大于2ml/min。尽量让所有上样样品都通过柱子流出来,即使柱中溶剂流干了也没有太大问题,但是要避免柱子完全溶剂流干

9、用10ml蒸馏水或纯化水清洗柱子

10 用气体吹扫或抽真空除去柱子中的残余的水

11 每次用1ml甲醇洗脱柱子,可洗2次。第一次加入的甲醇需用堵头堵住柱子下端,使甲醇在净化柱中保持5min后,再放出收集。

12 根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行HPLC分析

3HPLC分析方法:

黄曲霉毒素检测需要一台配有荧光检测器的HPLC系统。

黄曲霉毒素HPLC分析检测条件可参照以下设定:

流动相:水/甲醇/乙腈 60/30/15 (v/v) 流速:1.2ml/min

进样量:10-100µL;柱温:36

HPLC黄曲霉毒素专用分析柱:150×4.6mmRP C18(货号:10522

荧光检测器设置:EX.:365nm;Em.:460nm (使用柱后衍生系统,详见柱后衍生技术)

Em.:430nm用于黄曲霉毒素B类的检测和455nm用于黄曲霉毒素G类的检测

4、柱后衍生技术

HPLC分析中,为提高一些检测痕量目标物的灵敏度(如黄曲霉毒素B1G1),需要对检测的目标物进行衍生化,目前在HPLC中,以柱前衍生法和柱后衍生法居多,但柱前衍生法由于操作过程较繁琐,容易影响定量的准确性,不适合用于对大量样品做常规检测,而柱后衍生法操作简单,可连续反应以实现自动化分析,适用于大量样品的连续的自动化操作。

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一次性10ml注射器;0.2µm过滤膜;10ml移液管;1ml移液管;2ml容量瓶;

2、试剂

 所需试剂需要分析纯以上,并确保试剂对荧光分析结果没有影响。

Acetonitrile  乙腈;n-hexane  n-正己烷;methanol 甲醇;NaCl  氯化钠;

Na2HPO4·12H2O  十二水合磷酸氢二钠;Na2PO4·H2O  水合磷酸二氢钠;Tween20  吐温-20Water  蒸馏水或纯水。

仪器配置要求:

液相色谱系统一套

荧光检测器一套

HX-G光化学衍生系统一套

JJ-5均质器一套

HX-8泵流控制架(含泵)一套

免疫亲和柱(10支)一套

微孔滤头一套

混合标样一套(黄曲霉毒素G1B1G2B21ml

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